了解 IHC 和 IF 的对照

在此网络研讨会中，我们将介绍：

大家好，欢迎参加我们的网络研讨会，了解免疫组织化学和免疫荧光的控制。我叫 Rebecca Northeast，是欧洲的技术专家。我于 2020 年加入 Proteintech，之前获得了新陈代谢方向的博士后和博士学位。曼彻斯特大学神经科学博士。期间在实验室期间，我进行了许多免疫组织化学和 IF 实验。我希望我的经验与一些蛋白质科技智慧相结合能够帮助您从实验中获得最好的结果。这张幻灯片详细介绍了我们将在本次网络研讨会中介绍的内容。首先，为什么需要运行对照，强调 IHC 和 IF 方案固有的变异性、我们如何执行抗原和试剂对照、实验设计和最佳实践，以及如何处理免疫荧光实验中的自发荧光。

你们中的大多数人可能已经了解 Proteintech，但如果您不知道，这里是我们公司的介绍。自 2002 年以来，我们一直是抗体、Elisa 试剂盒和蛋白质的原始制造商。我们最近获得了 ISO 认证，这意味着我们可以生产用于细胞和基因治疗的 GMP 级细胞因子和生长因子。我们拥有五个全球库存站点，所有产品都有库存，可次日送达y。 Proteintech与其他抗体供应商的主要区别在于，我们自己生产所有产品，您只能购买带有我们标签的产品，通过省去中间商，不允许其他人以他们的标签销售我们的产品，我们为您提供完全透明。这意味着批次间的一致性更高，因为除了直接来自实验室的庞大原始验证数据库之外，我们还可以保证供应，并完全控制抗体的质量，确保它在您手中发挥作用。

Proteintech 有多克隆和单克隆抗体针对 13,000 个目标的抗体，其中针对两个半千个目标的抗体已通过 KO/KD 验证验证了其特异性。这是最广泛的击倒覆盖范围/knockout 抗体行业中经过验证的抗体。今年，我们推出了用于直接免疫荧光的 CoraLite 荧光染料抗体和用于蛋白质印迹的蛋白质阶梯。作为一家公司，我们特别通过您的科学成功来衡量我们的成功，帮助您更快地发表有影响力的研究。该图显示，在我们公司的历史上，我们的产品每年都会出现在越来越多的出版物中。截至目前，我们的出版物引用次数已超过 70,000 次。

现在继续今天网络研讨会的主题，为什么对照对于抗体应用实验如此重要，执行对照可确保您的结果在生物学上是真实的，有助于最大限度地减少变量，并使您能够将数据与您的数据进行比较自己的研究和其他人的研究。在一篇有关 IHC 实验对照的论文中，他还指出，简单地说，缺乏对照的免疫组织化学测定无法得到有效解释。本质上，这个我由于 IHC 实验的性质，我们需要确保我们观察到的结果在生物学上是真实的，而不是对伪影或非特异性结合的误解。在实验室期间，我遇到了这些与我自己和其他人的工作有关的问题。诸如此类的问题是，这是特定的染色还是只是人工染色？我的抗体是否不起作用或者我的治疗是否降低了靶标表达？如何将我的样本结果与以前学生的结果或与本文引用的论文不同的实验室的结果进行比较？是我的显微镜坏了还是试剂坏了还是我的样品坏了？我如何知道什么是生物信号或什么是自发荧光？答案是什么？答案是执行适当的控制，以了解结果显示的内容。

我们的 IHC 和 IF 实验的变异性在哪里？固有的可变性是通过室温等因素发生的自然。例如，夏季和冬季室温之间的差异，这会影响 H2O2 阻断、抗体结合、底物反应和染色质发育的酶动力学，基本上影响任何需要酶的事物。试剂存在批次间差异，请务必记下每次实验中使用的批次，以便将来获得不同结果时可以回来查看，因为这可能是由于批次变化造成的。人为错误也可能导致变异，确切的孵化时间可能会发生变化，也许应用技术也会发生变化。例如，您是否在经过一夜孵化后的某一天早上晚些时候才回来？也可以通过主观评估获得变异性。这对于需要对色原发育进行主观评估的实验（例如 DAB）以及任何结果分析尤其重要。例如，对活化细胞进行计数。您还可以使用 pip 获得可变性埃特错误。我们每次都会添加少量抗体，因此此处的更改会对浓度产生很大影响，并始终确保定期维护和校准您的移液器。

我不会在这里详细介绍整个协议，但简而言之，在免疫组织化学中，结果变异的主要来源是步骤，例如封闭、一抗孵育、二抗孵育和 DAB 显色。这些步骤包含最大的可变性，例如室温、孵育时间和缓冲液成分的变化。通过执行对照，我们可以帮助在我们自己的结果中进行比较，以解释这些变量。

在免疫荧光实验方案中，我们发现与前面提到的 IHC 实验方案类似的步骤存在差异。对于 IF，由于组织的透化，我们还获得了更多的变异性。例如，透化时间的变化或透化剂浓度的轻微变化将控制ol 有多少抗体可以到达细胞内靶标。同样，通过 IF，我们将荧光团连接到我们的二抗上。使用与我们的二级荧光团缀合的荧光团，我们在样品制备和显微镜分析过程中的曝光量上会存在固有的差异，这反过来会影响荧光团死亡的亮度并可能改变结果。

现在，我将继续讨论您需要运行哪些对照以及原因。在我们的第一组试剂对照中，我们需要检测观察到的信号是否针对目标。为了做到这一点，我们可以先放在一边，它已经以完全相同的方式处理，但一抗已从孵育缓冲液中去除。确保我们仍然将其他试剂添加到缓冲液中并与其他面一起孵育。然后我们将正常添加二抗并可视化侧面。如果您正在运行多重免疫荧光实验，确保您对所有二抗分别进行此操作，此控制非常重要，并确保观察到的信号对于您的目标而言是生物学上真实的，而不仅仅是二抗的非特异性染色。内源对照是指在这两个步骤中省略缓冲液中的一抗和二抗。确保您的样品以完全相同的方式处理，因为这将揭示样品中的自发荧光水平，这很容易被误认为是特定染色。稍后我将在本次演讲中介绍如何处理自发荧光。另一种试剂对照是同种型对照。您可以在此处将一抗替换为相同同种型的抗体，例如多克隆抗体。这里的变化是该抗体是非免疫的，因此 Fab 部分不会与样品中的任何特定表位结合。确保同种型对照抗体的浓度为与您的主要实验相同并且同时运行。如果您从与一抗相同的供应商处购买同型对照，也是更好的选择。这是无一抗的更复杂版本，因为它还可以解释该抗体介导的任何 FC 结合以及样品中的任何非特异性一抗结合。

为了确保我们的结果是有效的，在我们的实验中运行抗原对照也非常重要。这在试验新抗体或新细胞系和组织时尤其重要。运行样本是阳性对照，我们知道它表达目标抗原，将确保我们的方案有效，并验证任何阴性结果。您可以通过研究文献或使用目标蛋白的过度表达遗传细胞系来找到潜在的阳性对照。

您的阴性对照应包含已知不表达靶标的组织或样本，例如该细胞系，该细胞系已被 siRNA 敲低HADHA，这大大减少了 HADHA 特异性抗体的信号。这将揭示由于非特异性抗体结合而导致的假阳性或非特异性信号。Uniprot 或 PaxDB 有助于找到阴性对照。此外，CRISPR KO 还可用于敲低您的目标蛋白。

如果可能，全套对照应与每个实验一起运行。但是，由于样本限制或可以运行的样本数量的限制，有时这是不可能的然而，在试验新的样品类型（例如不同的细胞系或组织、新的抗体或试剂或新的试剂库存）时，最重要的是运行全套对照，如果您的批号发生变化，这一点尤其重要。对于诸如此类的事情很重要多克隆抗体。由于多克隆抗体的性质，不同批次意味着它将识别不同的表位组合，因此可能产生不同的结果。例如，在重新运行实验以增加 N 个数字时，您还需要运行对照。最重要的是，始终在主要实验幻灯片的同时运行对照。这意味着缓冲液组合物的孵育时间和室温将完全相同，也就是说，我们将消除多个级别的变异性。

这是一个实验幻灯片集以及全套控件的示例。主要实验应该包括我们所有的主要实验组，无论幻灯片有多少。您的对照应包括抗原对照，因此是阳性和阴性目标表达样本。您的试剂对照应该是内源性组织的试剂对照，其中没有初级也没有次级达瑞抗体。您的二抗仅控制发射一抗的位置，其中包括您为每个荧光团运行的二抗，以及一抗同种型对照。如果您需要试剂、染色装置中的空间，或者由于珍贵的组织而受到限制，则您必须始终运行的两个对照是内源对照和次要对照。这些将有助于解释样品中可能存在的大部分非特异性染色和任何自发荧光。

如上所述，始终运行您的与您的主要实验一起进行控制。如果由于实验设置中的空间限制而必须执行多轮染色，请确保实验组在各轮之间均匀分配。所以这是为了例如，如果您有两组实验，则为最佳设计。因此，如果您的实验中有两组，这是最好的设计。因此，如果您要对第一轮进行染色，我们将拥有对照组以及来自第一组和第二组的同等比例的参与者。在第二轮染色中，同样将第一组和第二组等量混合。这是一个糟糕的设计，因为我们无法说明我们在第一组和第二组之间划分时看到的结果是由于生物学上的真实数据，或者只是由于每轮染色中获得的固有变量的变化.

在 Proteintech，我们最近推出了 CoraLite 偶联抗体系列。这些将有助于简化您的免疫荧光实验方案，因为无需流行的 CoraLite 偶联一抗即可执行直接免疫荧光，从而减少对二抗的需求，并防止由于二抗的性质而可能在样品中发生任何非特异性结合.

今天要讨论的最后一个话题是自发荧光。自发荧光是由于组织中的背景荧光引起的，这不归因于特异性抗体-抗原结合。正如您在 FFPE（福尔马林固定石蜡包埋的人类肾脏组织）中所看到的，在 550 纳米绿光波长下，您仍然可以在该样本中看到一些明确的生物学特征。然而，这只是一个完全未染色的样本。由于福尔马林固定导致荧光醛加合物，我们得到自发荧光。红细胞含有荧光化合物血红素和胶原蛋白，它们也是荧光的。还有一些代谢化合物，例如 NADH，也具有天然荧光。那么我们如何修复自发荧光或如何最大限度地减少其影响呢？做到这一点的一种方法是始终包含内源染色对照，这样当我们查看样品时，我们可以分辨什么是纯自发荧光，什么是纯自发荧光。生物信号。大多数自发荧光发生在绿色光谱中。因此，正如我们在上一张图片中看到的那样，当在绿色滤光片与红色滤光片下拍摄时，您可以在绿色滤光片和红色滤光片下看到更多明确的生物特征，因此自发荧光已经自然减少这个过滤器。与此相一致，使用红色和远红色荧光团（例如 CoraLite594 或 CoraLite647 荧光团）将有助于立即最大限度地减少这种影响。我们可以帮助减少自发荧光的另一种方法是仅在所需的最短时间内固定样品，并灌注 PBS 以去除任何红细胞和天然荧光化合物血红素。流行的商业试剂，例如 True View，如果在染色之前使用，也有助于减少任何荧光。

本次演讲的主要信息是，控制抗体应用中至关重要的一个因素，以确保染色的有效性我们的结果。为您和您的实验提供最佳控制的研究以及该应用程序始终在您的实验旁边运行控制，对您的抗体供应至关重要，并确保他们在抗体到达您手中之前已对其进行了正确验证并可以显示其原始数据。这里有一些有用的资源，可帮助您找到实验的最佳对照。因此，UniProt Impact DB 等网站将帮助您查找不同组织中的蛋白质序列和蛋白质表达，以及 Proteintech 网站，其中包含特定于应用程序的提示和技巧以及可供您遵循的特定于产品的方案。感谢您的聆听。请随时通过 rebecca@ptglab.com 与我联系，祝您有美好的一天。